Il film inizia con un'ambientazione western che vede lo sceriffo Woody, Buzz e Jessie dare la caccia a Burt il guercio (Mr. Potato), Betty la guercia (Mrs. Potato) e al malvagio Dottor Prosciutto (Hamm). I personaggi fra loro ripetono le stesse frasi che Andy usa nell'introduzione del primo film come «ho portato il mio cane con scudo galattico». Proprio nel finale di questa fantastica avventura si scopre che tutto ciò nasceva dall'immaginazione di Andy e questa scoperta apre una serie di filmati, ripresi da una telecamera amatoriale, in cui si vede Andy bambino giocare con tutti i suoi giocattoli. Come sottofondo viene nuovamente usata la canzone "Hai un amico in me" di Randy Newman (nella versione italiana canta Riccardo Cocciante).

Alla fine dei filmati Andy, ormai diciasettenne, si sta preparando per partire per il college. Intenzionato a non gettare via i suoi vecchi giocattoli, Andy apre il suo vecchio baule e, dopo aver messo dentro un sacco tutti i giocattoli rimanenti, si ritrova davanti Woody e Buzz. Il ragazzo mette Woody nella scatola degli oggetti da portare al college, mentre Buzz finisce nello stesso sacco in cui gli altri giocattoli nel frattempo si stanno agitando. Poco prima di mettere il sacco in soffitta, la sorellina Molly chiede aiuto ad Andy per trasportare alcune sue cose e lui appoggia il sacco con tutti i giocattoli a terra; la mamma di Andy prende il sacchetto, credendo che fosse spazzatura, e lo mette sul marciapiede. Woody, che ha visto tutta la scena, chiama Buster, ma il cagnolino è ormai anziano e a stento riesce a reggersi in piedi. Il cowboy raggiunge i sacchi della spazzatura, temendo che i suoi amici vengano messi nel camion passante, ma scopre che i compagni si sono salvati e hanno raggiunto la macchina della signora Davis, madre di Andy. Lì scopre che i suoi amici, delusi dal comportamento di Andy, vogliono raggiungere l'asilo Sunnyside dove è diretta la signora Davis. La prima Jessie cerca di far ragionare Woody, ma questo spiega ai suoi amici che c'è stato uno sbaglio, che Andy aveva intenzione di metterli in soffitta. Ma la madre di Andy mette in moto la macchina, ed i giocattoli stanno inevitabilmente per andare all'asilo.

Arrivati, scoprono che il posto è un vero paradiso, e il capo del posto Lotso, un orso peluche rosa dal profumo di fragola, spiega che tutti i giocattoli dai cuori infranti sono i benvenuti al Sunnyside e gli mostra, convinto della loro permanenza, la loro aula. Woody però è disposto a dire addio a tutti i suoi amici tentando più di una volta di farli ragionare, ma vedendo anche Buzz convinto di non tornare da Andy lascia il Sunnyside. Dopo una rocambolesca e fortunosa fuga, Woody viene trovato e prelevato da una bimba di nome Bonnie, figlia della proprietaria dell'asilo. Nel frattempo Buzz, Jessie, Bullseye, Slinky, Rex, Hamm, i coniugi Potato e gli alieni di Pizza Planet scoprono che la classe a loro assegnata è quella destinata ai bimbi più piccoli e, restando brutalizzati, decidono di parlare con Lotso.

Il portavoce è Buzz ma al primo colloquio viene imprigionato e impostato nella modalita demo. Lo space ranger diventa nemico dei suoi amici e scordandosi di tutti i bei momenti passati assieme contribuisce a farli imprigionare. Nel frattempo Woody conosce i giocattoli di Bonnie che gli rivelano la vera identità di Lotso e deciso ad aiutare i suoi amici, così il cowboy torna all'asilo. Grazie all'aiuto di Telefono chiaccherone, riesce a spiegare ai suoi compagni il piano di fuga da effettuare durante la notte. Accidentalmente resetteranno Buzz nella sua modalità spagnola, anche se ciò non gli comporterà nessun tipo di guai se non a Jessie, la quale verrà corteggiata più volte. I giocattoli useranno uno scarico per spazzatura per uscire dall'asilo ma Lotso e i suoi scagnozzi riescono a trovarli. Woody e Ken però riescono a convincere Bimbo (la spalla destra dell'orso), il quale getterà con rabbia Lotso nel bidone dell'immondizia.

Lotso però riesce ad afferrare una gamba di Woody trascinandolo nella spazzatura poco prima che il camion della spazzatura arrivi, forzando così gli amici del cowboy a gettarsi per salvarlo. Nel caos dentro il camion Buzz salva Jessie prendendosi in testa un televisore, ma proprio grazie al forte colpo quest'ultimo tornerà alla sua versione normale non ricordandosi delle sue altre modalità. Il camion porta i giocattoli nella discarica dove vengono spinti in una sezione distruggi rifiuti. Woody e Buzz aiutano Lotso, il quale era rimasto incastrato tra i rifiuti, riuscendolo a salvare, ma i giocattoli vengono spinti verso l'inceneritore. Ora è Lotso ad aver la possibilità di salvarli ma, invece, decide di lasciarli al loro destino. Ai giocattoli ormai non rimane che accettare la loro imminente fine, ma per fortuna vengono salvati da un artiglio gigante manovrato dai tre pupazzi alieni. Lotso avrà una brutta fine venendo trovato da un netturbino, il quale decide di legare il peluche davanti al proprio camion che usa per lavoro.

Woody e i suoi amici ritornano a casa su di un camion della spazzatura e si preparano ad essere messi in soffitta, ma il cowboy decide all'ultimo momento che lui e i suoi amici devono continuare, insieme, il loro compito da giocattoli da qualche altra parte, quindi lascia un post-it a Andy suggerendogli di donare i suoi giocattoli ad un indrizzo, che è dove abita Bonnie. Il film si conclude con un addio reciproco fra Andy e i suoi giocattoli che descrive come loro lo hanno fatto divertire. Insieme a Bonnie, infine, Andy giocherà con i suoi amici un ultima volta prima di partire per il college. La scena finale vede Woody guardare verso la ormai sempre più lontana macchina di Andy, riuscendo a strappare dalle sue labbra commosse un «Addio amico».

Il film non finisce perché nella scena seguente i giocattoli rimasti al Sunnyside mandano una lettera, scritta da Ken e infilata nello zainetto di Bonnie, a Woody e ai suoi amici per fargli sapere come l'asilo, gestito da lui e da Barbie, sia diventato un paradiso per tutti perché i membri che ne fanno parte si aiutano a vicenda per resistere ai giochi dei bambini e si divertono di notte quando nessuno li vede.